Mirus Label IT?——高效、一步法用于體內和體外核酸標記的新技術(shù)

細胞轉染科學(xué)研究中扮演著(zhù)十分重要的角色,但最容易被忽略的一環(huán)。轉染效率的高低不僅影響實(shí)驗結果,甚至可能導致得到的實(shí)驗結果是無(wú)效的。在多種類(lèi)型核酸的細胞轉染實(shí)驗中,研究者們需要進(jìn)一步優(yōu)化轉染條件以達到最優(yōu)的轉染效率,特別是較難轉染的細胞,而針對特定細胞類(lèi)型選擇對應專(zhuān)業(yè)化的轉染試劑只是邁向轉染實(shí)驗成功的第一步。

成立于1995年的Mirus Bio,專(zhuān)注及深耕核酸遞轉領(lǐng)域多年,從最早具有低毒性的TransIT ? -LT1GMP級別、可用于AAVLV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN? (產(chǎn)品年鑒請見(jiàn)圖1)。直至文稿發(fā)布時(shí),使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過(guò)1萬(wàn)篇,并且發(fā)表文章及Mirus數據庫涵蓋了超過(guò)1200細胞類(lèi)型。

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1 Mirus產(chǎn)品年鑒

在細胞轉染實(shí)驗中,研究者們常常會(huì )忽略轉染效率/成功率的評估,那么是否有對應技術(shù)或者方法允許實(shí)時(shí)監測DNA/RNA的成功遞送以及細胞內的分布狀態(tài)呢?Mirus Bio Label IT? 核酸標記試劑盒為廣大的科研工作者提供了一個(gè)方向。Label IT? 核酸標記試劑盒可對任何類(lèi)型核酸,進(jìn)行高效、直接的標記,并且為on-step的實(shí)驗操作。基于非反應的標記方法,在不損傷核酸完整性、影響基因表達的前提下,選擇的標記 (熒光、生物素、地高辛等)共價(jià)方式連接到核酸上。

Label IT? 試劑盒有多種標簽可供選擇,包括 Cy?3、Cy?5、CX-羅丹明、TM-羅丹明、熒光素、MFP488、地高辛、生物素和二硝基苯基(DNP)。Label IT? 核酸修飾試劑盒(胺)也可用于基于功能基進(jìn)行DNARNA修飾。產(chǎn)品特點(diǎn)如下:

  • 可用于標記任何DNARNA模板——適用于多種應用 (In vitro & in vivo),如Crispr基因編輯、核酸遞轉、RNA干擾/表達實(shí)驗、FISH、Microarray;
  • 一步法標記——簡(jiǎn)單、輕松即可完成穩定的模版標記反應;
  • 可根據實(shí)驗需求或應用,調節標記的密度——以獲得最佳檢測標記 DNA RNA 的靈敏度;
  • 基于共價(jià)化學(xué)反應——對核酸殘基的修飾為永久性、無(wú)損傷,是多種科研應用的理想選擇。

  • 什么是核酸標記?如何標記核酸?如何檢測?

絕大多數基于分子和生物學(xué)的In vitro in vivo研究都依賴(lài)于核酸的標記或標簽,理想情況下,此類(lèi)標記或標簽不會(huì )影響核酸功能以及研究結果。因此,也發(fā)展出來(lái)多種核酸標記方式,大致可以歸為以下兩類(lèi):

-????? 化學(xué)標記法基于結合核酸的反應基團,比如Mirus Label IT? 核酸標記試劑盒屬于此類(lèi),并且整個(gè)反應過(guò)程并不需要酶的參與。

Label IT? 化學(xué)標記試劑由三個(gè)部分組成(如圖2

(1)????? 標簽/標記 (綠色區域);

(2)????? Linker,與核酸進(jìn)行靜電相互作用 (黃色區域);

(3)????? Label IT? 試劑以共價(jià)形式連接到核酸中活性雜原子的烷基基團(藍色區域)。

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2. Label IT?標記分子示意圖

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-????? 基于酶反應標記法:通過(guò)酶促反應,在該反應過(guò)程中加入標記修飾的核酸。

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當待研究的核酸加入標記后,可通過(guò)以下兩種方式進(jìn)行檢測:

-????? 直接檢測這時(shí),標記的核酸中包含了可用于光學(xué)、發(fā)光或產(chǎn)生熒光信號的報告分子。

-????? 間接檢測:標記的核酸帶有標簽或標記,該標記需要特異性的結合報告偶聯(lián)分子,如生物素結合帶有熒光標記的鏈霉親和素,地高辛結合帶有熒光標記的特異性抗體等。

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  • Label IT? 核酸標記試劑盒——不改變核酸結構功能

基因沉默相關(guān)功能研究在分子和細胞生物學(xué)中發(fā)揮著(zhù)重要作用,化學(xué)轉染也在該研究領(lǐng)域扮演者重要角色。小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA),作為研究各種類(lèi)型細胞中蛋白功能核酸類(lèi)型,通過(guò)有效的knockdown從而影響基因表達。那么,加入Label IT?標記的核酸,是否會(huì )改變核酸結構,從而影響到后續實(shí)驗結果呢?

評估測試使用Label IT? siRNA Tracker? 試劑盒,將相同siRNA加入不同標記 (CyTM3, CyTM5, 熒光素, CX-羅丹明 )以及沒(méi)有標記siRNA,轉染后,可通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察到帶有標記的siRNA?;虮磉_結果顯示,帶有不同標記的siRNA,其目的基因表達水平近似,意味著(zhù)加入Label IT?標記的核酸,并不影響目的基因表達及功能 (3)。

HeLa cells in 12-well plates were transfected at 70% confluence with TransIT-TKO? Transfection Reagent (3 μl/well) and Label IT? siRNA Tracker? Fluorescein-labeled siRNA duplexes (GREEN, 50 nM final concentration in the well)

3? Label?IT? siRNA Tracker? 試劑盒評估測試

  • Label IT? 核酸標記試劑盒——前沿應用舉例

應用一:使用Label IT?技術(shù),富集CRISPR'd細胞

Nasri Mir 等人在文章中闡述了如何通過(guò) Label IT? 技術(shù),富集 CRISPR/Cas編輯成功的細胞?;蚪M編輯實(shí)驗面臨最大的挑戰之一是如何從未編輯的細胞中成功的篩選/富集出成功編輯的細胞,特別當未被編輯的細胞相對于成功編輯細胞,具有生長(cháng)/增殖優(yōu)勢,使得細胞篩選變得更加困難。

為了高效的區分經(jīng)過(guò)基因編輯及未編輯的細胞,作者在CRISPR引導RNA ( gRNA) Cas9 形成復合物轉染細胞前,使用Label IT?gRNA進(jìn)行了熒光標記,實(shí)驗流程示意圖如下:

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研究結果表明,使用Label IT?標記的gRNA 不會(huì )影響基因編輯效率,并且可通過(guò)熒光分選/富集成功編輯的細胞群。進(jìn)一步地,研究者們將該 CRISPR 實(shí)驗流程應用于針對多種細胞類(lèi)型的GADD45B基因編輯實(shí)驗。根據細胞類(lèi)型的不同,經(jīng)過(guò)Label IT?標記的細胞亞群中,其成功編輯細胞占比相對于總細胞群體提了15-40%。

發(fā)表文章信息:

標題:?Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者:?Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
雜志:?Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI:?10.1182/bloodadvances.2017015511

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應用二:使用Label IT?技術(shù),聚焦于免疫系統研究

Label IT? 核酸標記技術(shù)可用于一種新型疫苗注射方法-微針陣列(microneedle array, MNA)的表征研究。傳統的疫苗注射方法是通過(guò) 3 厘米以上長(cháng)度的針頭進(jìn)行皮下注射,而微針陣列是由微米級針頭所組成(示意圖如下),以無(wú)痛的方式細微的的穿透皮膚,進(jìn)入富含免疫細胞群,減少患者的不適感。

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為了提高疫苗的效力(efficacy),通常會(huì )將免疫刺激分子或 "激動(dòng)劑(agonists) "與疫苗的靶標或原一加入疫苗制劑中。Edwards 等人的研究表明,雙鏈 polyIC RNA 和單鏈 CpG DNA 核苷酸可作為微陣列中的激動(dòng)劑(agonists)。并且,研究者們認為帶負電荷的核酸激動(dòng)劑(agonists)和帶正電荷的抗原之間的靜電相互作用,幫助了微陣列的組裝。通過(guò)使用 Label IT? Cy?3 Cy?5 ,分別針對以上兩種核酸類(lèi)型進(jìn)行熒光標記,方便用于查看標記核酸在微上的分布,這樣就允許了研究者們按照所需要的特定比例,將兩種激動(dòng)劑均一的加入到微陣中,從而使得精確的調整微針陣列 MNA 疫苗的免疫反應成為可能。

發(fā)表文章信息:

標題:?Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者:?Camilla Edwards, Robert Oakes?et al.
雜志:?Nanoscale,?Volume 15, Apr 2023.
DOI:?10.1039/D3NR00333G

  • Label IT? 核酸標記試劑盒-產(chǎn)品選擇

Label?IT?試劑盒有以下四種形式可供選擇,以應對研究人員核酸標記實(shí)驗的不同應用場(chǎng)景需求

  • Label?IT??Nucleic Acid Labeling Kits
  • Label?IT?Tracker? Intracellular Nucleic Acid Localization Kits
  • Label?IT??siRNA Tracker? Intracellular Localization Kits
  • Label?IT??Nucleic Acid Modifying Kits

下表總結了不同種類(lèi)Label?IT?試劑盒區別

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Label?IT? Nucleic Acid Labeling

Label?IT? Tracker?

Label?IT? siRNA Tracker?

Label?IT? Nucleic Acid Labeling Modifying

應用

in vitro?&?in vivo應用的多種類(lèi)型核酸標記

in vitro?&?in vivo質(zhì)粒追蹤實(shí)驗

in vitro?&?in vivo siRNA追蹤實(shí)驗

DNA氨基修飾

試劑盒組分

Label IT? Reagent Reconstitution Solution

10X Labeling Buffer

Reagent D1& Buffer N1

G50 Microspin Columns

Label IT? Reagent Reconstitution Solution

10X Labeling Buffer

Label IT? Reagent Reconstitution Solution

10X Labeling Buffer

siRNA Dilution Buffer

Label IT? Reagent Reconstitution Solution

10X Labeling Buffer

Reagent D1& Buffer N1

G50 Microspin Columns

Label?IT? : 核酸比例

1 μl? : 1 μg

0.5 μl? : 1 μg

1 μl? : 1 μg

0.5 μl? : 1 μg

標記密度

20-60 bp 1個(gè)標記

60-140 bp 1個(gè)標記

15-40 bp 1個(gè)標記

20-60 bp 1個(gè)標記

標記物類(lèi)型

Cy?3

Cy?5

熒光素

CX-羅丹明

TM-羅丹明

生物素

MFP488

地高辛

DNP

Cy?3

Cy?5

熒光素

CX-羅丹明

TM-羅丹明

生物素

Cy?3

Cy?5

熒光素

CX-羅丹明

TM-羅丹明

生物素

氨基

試劑盒規格

25 μl

100 μl

50 μl

50 μl

25 μl

100 μl

  • 更多有關(guān)產(chǎn)品常疑問(wèn)FAQ,請查看官網(wǎng)鏈接

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  • Label IT? 核酸標記試劑盒-實(shí)驗優(yōu)化之核酸標記密度

理想的密度取決于被標記的核酸類(lèi)型及下游應用。在需要直接追蹤核酸的實(shí)驗中,更適合較高的核酸標記密度;而在想要維持/完整的還原標記核酸生物學(xué)功能的實(shí)驗中,更加適合較低的標記密度。使用 Label IT? 核酸標記技術(shù),可以輕松調整到理想的標記密度。

Label IT? 試劑與核酸的比例(v:w)的改變與標記密度呈線(xiàn)性相關(guān)性(4)。例如,按照說(shuō)明的初次實(shí)驗建議,需加入 5 μl Label IT? 試劑標記 5 μg DNA,此時(shí)v:w比例為1:1。在保證孵育時(shí)間和 DNA 量不變的條件下,如將 Label IT? 試劑的量降低為 2.5 μl 或 增加到10 μl,標記密度將分別降低一半或增加一倍。

實(shí)驗Tips:使用過(guò)高的 Label IT? 試劑量(超過(guò)建議量的 4 倍),可能會(huì )導致核酸裂解或引起 Label IT? 熒光基團淬滅。

核酸標記密度與所使用的 Label IT? 試劑量及反應的孵育時(shí)間呈正線(xiàn)性相關(guān)???/span>通過(guò)調整反應中 Label IT? 試劑的用量或反應的孵育時(shí)間 (孵育溫度仍為37),可輕松靈活的調整到所需要的理想標記密度。

4. 核酸標記密度與Label IT?試劑用量和反應孵育時(shí)間成正比

實(shí)驗Tips如何計算核酸標記密度,詳細實(shí)驗步驟及方法請見(jiàn)Calculate Nucleic Acid Labeling Density”。

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Mirus Bio公司介紹

Mirus成立于1995年,始終秉承著(zhù)為基因遞轉提供最佳方法及最高效的工具。憑借超過(guò) 25 年轉染領(lǐng)域的深根細作,獲得了多項技術(shù)突破,已成為核酸遞送領(lǐng)域的全球領(lǐng)導者和值得信賴(lài)的品牌。Mirus科學(xué)家團隊不斷突破轉染技術(shù)的極限,推出了VirusGEN?轉染試劑與RevIT?增強劑,進(jìn)一步提升AAV/Lv產(chǎn)量,助力推動(dòng)生物治療藥物的降本增效,為CGT領(lǐng)域客戶(hù)賦能。

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北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區代理,始終秉承著(zhù)專(zhuān)業(yè)、嚴謹的態(tài)度為客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù),Mirus熱銷(xiāo)轉染產(chǎn)品常備現貨。如果您對上述產(chǎn)品感興趣,歡迎致電北京西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.mm2332.com了解更多產(chǎn)品信息。

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