HCPure?多模式層析填料,助力生物制品的高效純化

近年來(lái),生物制藥行業(yè)呈現出繁榮發(fā)展的趨勢,很多大分子生物制品已經(jīng)過(guò)監管部門(mén)批準上市,另有不少創(chuàng )新型大分子正處于臨床后期或上市前申報階段,即將為患者帶來(lái)福音。例如,基于CHO細胞表達的單克隆抗體、基于大腸桿菌E.coli體系表達的重組蛋白或納米抗體、基于HEK293細胞或昆蟲(chóng)細胞SF9表達的腺相關(guān)病毒(AAV)、基于酵母細胞表達的病毒樣顆粒(VLP)等。不同于傳統的小分子化學(xué)藥,生物大分子的表達體系更為復雜,雜質(zhì)種類(lèi)更多宿主蛋白(HCP)和宿主DNA殘留(HCD),雜質(zhì)結構相對復雜,這給下游純化帶來(lái)了極大的挑戰。

         基于傳統微球技術(shù)的層析工藝是生物大分子純化的重要手段,具有工藝性能穩定、放大性良好等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái),多模式層析填料受到越來(lái)越多的關(guān)注。多模式層析填料往往具備至少兩種相互作用機制,其中最常見(jiàn)的是將離子交換模式與疏水相互作用模式結合,可以在廣泛的pH和電導率范圍內有效純化目標分子。

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圖1. HCPureTM配基結構和作用方式

       

HCPureTM英國Astrea Bioseparations公司2023年推出的多模式層析填料,填料基架為粒徑均一的高交聯(lián)瓊脂糖,基架上修飾有化學(xué)合成的小分子配基(圖1),主要以疏水相互作用的方式結合料液中的雜質(zhì),同時(shí)兼具氫鍵相互作用模式(與市售主流產(chǎn)品作用原理不同,形成互補),適用于多種表達體系,在廣泛的上樣條件下,能穩健的去除料液中的HCP(宿主細胞蛋白)、HCD(宿主細胞DNA)、聚集體、分子片段等工藝或產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。表1展示了HCPureTM在常見(jiàn)的表達體系中雜質(zhì)去除能力。

表1. HCPureTM在多種表達體系中的應用效果

 

1. HCPureTM大腸桿菌(E. coli 表達體系中可以有效去除HCP

在該應用案例中,研究人員使用大腸桿菌(E. coli )表達納米抗體Vκ,收獲液先經(jīng)過(guò)Protein L親和層析純化,洗脫液經(jīng)中和后調節成不同的pH(6.0-8.0)和電導率(6-18mS/cm),隨后以流穿模式上樣HCPureTM,收集流穿液和淋洗液,檢測Vκ和HCP的含量,以探究HCPureTM的最佳上樣條件。測試條件如下表所示:

 

2. E.coli表達體系中HCPureTM上樣pH和電導率的探究

 

圖2的檢測結果可知,在較低的pH(6.0)和較低的電導率(6ms/cm)上樣條件下,HCP的去除效果最佳,同時(shí)目標分子Vκ的回收率最高。在最優(yōu)上樣條件下,料液中的HCP可以從30000ppm降至200ppm(2個(gè)log值的去除能力),Vκ回收率大于85%(表2)。

2. HCPureTME. coli 表達體系中可以有效去除HCP

 

2. HCPureTM在CHO細胞表達體系中可以有效去除HCP

在該應用案例中,研究人員使用CHO細胞表達IgG型單克隆抗體,澄清后的收獲液先經(jīng)過(guò)Protein A親和層析純化,洗脫液經(jīng)中和后調節成不同的pH(4.0-9.0)和電導率(8-18ms/cm),再以流穿模式上樣到HCPureTM中,收集流穿液和淋洗液,檢測IgG和HCP含量,其中,pH 6.0、電導率12ms/cm是未經(jīng)調節的親和層析洗脫中和。

3. CHO細胞體系中,不同上樣pH和電導率條件下,HCPureTM均可有效去除HCP

 

3的檢測結果可知,廣泛的上樣pH和電導率范圍內,HCPureTM均可有效的去除上樣料液中的HCP平均84%),同時(shí)保持目標分子的高回收率(平均87%)。此外,由于pH 6.0、電導率12mS/cm是初始的親和層析洗脫中和液,因此,親和層析后,料液可不經(jīng)過(guò)調整或緩沖液置換,直接上樣到HCPureTM中,同樣保持優(yōu)秀的回收率和HCP去除效果,且大大節約了工藝時(shí)間和成本。

 

3. HCPureTM在CHO細胞表達體系中可以有效去除聚集體

在該應用案例中,研究人員使用CHO細胞表達IgG型單克隆抗體,料液經(jīng)過(guò)Protein A親和層析和陽(yáng)離子交換層析純化后,在較低的pH和較高的電導率條件下孵育,誘導產(chǎn)生高含量的聚集體,再以流穿模式上樣HCPureTM,收集流穿液和淋洗液,檢測聚集體含量。

4. HCPureTM可顯著(zhù)去除抗體料液中的聚集體

 

由檢測結果(表4)可看出,料液經(jīng)過(guò)HCPureTM純化后,聚集體由初始的6.7%低到2.9%,HCPureTM可顯著(zhù)去除料液中的聚集體。

 

4. HCPureTM在HEK 293細胞表達體系中可以有效去除HCP

在該應用案例中,研究人員使用HEK293細胞以瞬轉的方式表達2型腺相關(guān)病毒(AAV-2),病毒載體經(jīng)過(guò)親和層析純化,仍含有較高含量的低分子蛋白雜質(zhì),將親和層析洗脫液置換到PBS+200mM NaCl(pH 7.5),以流穿模式上樣到HCPureTM10mm內徑層析柱,柱高10cm),總上樣量為5.0E+13VP,收集流穿液和淋洗液進(jìn)行分析。

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3. SDS-PAGE檢測結果

 

5. ELISA檢測結果

 

由SDS-PAGE結果(圖3)看出,流穿液中包含大部分病毒衣殼蛋白VP1,VP2和VP3條帶(8-13泳道,而再生液(14泳道中則包含大量的低分子蛋白雜質(zhì)條帶,表明HCPureTM可以有效去除料液中的蛋白雜質(zhì)分子。由ELISA檢測結果(表5可知,流穿液中的病毒衣殼蛋白幾乎全部回收(接近100%),表明HCPureTM在去除蛋白雜質(zhì)的同時(shí)可以保持優(yōu)秀的AAV回收率。

 

HCPureTM多模式層析填料技術(shù)參數

 

HCPureTM多模式層析填料產(chǎn)品信息

散裝填料

 

預裝柱

 

如您對上述產(chǎn)品感興趣,歡迎點(diǎn)擊這里填寫(xiě)信息,Astrea Bioseparations技術(shù)專(zhuān)家將為您提供個(gè)性化優(yōu)化方案,切實(shí)幫您解決純化工藝中的疑難問(wèn)題。

 

Astrea Bioseparations1987年孵化自劍橋大學(xué),擁有超過(guò)30年層析介質(zhì)研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗,是世界級層析介質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)供應商。目前使用Astrea的產(chǎn)品已有超過(guò)21個(gè)生產(chǎn)工藝通過(guò)了FDAEMA的批準。Astrea Bioseparations在全球擁有3個(gè)研發(fā)和生產(chǎn)基地,專(zhuān)注為生物大分子和CGT領(lǐng)域提供行業(yè)領(lǐng)先的層析介質(zhì)和技術(shù)服務(wù)。Astrea Bioseparations推出的基于納米纖維的新型層析技術(shù),解決了傳統生物分離工具載量低和工藝耗時(shí)問(wèn)題,實(shí)現更快、更環(huán)保、更具成本效益的純化過(guò)程,完全符合當今生物治療創(chuàng )新的需求。

 

西美杰是Astrea Bioseparations中國代理,為用戶(hù)提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。歡迎隨時(shí)撥打西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.mm2332.com了解更多信息。

 

參考文獻

  1. J. Kreusser et al., Influence of pH value and salts on the adsorption of lysozyme in mixed-mode chromatography, 2021
  2. R. Hess et al., Standardized method for mechanistic modeling of multimodal anion exchange chromatography in flow through operation, 2023
  3. Technical Note: HCPURE?: A FIT FOR PURPOSE HOST CELL PROTEIN CLEARANCE SOLUTION IN E. COLI WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
  4. Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
  5. Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
  6. Technical Note: HCPURE?: HOST CELL IMPURITY REMOVAL IN CHO WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
  7. Technical User Guide: HCPureTM, Astrea Bioseparations


 

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